Определение агглютинация. Агглютинация специфическая

Если на фарфоровую тарелочку со смачиваемой поверхностью по­местить каплю сыворотки, содержащей определенный агглютинин и доба­вить каплю крови (в соотношении 10:1), в эритроцитах которой содержит­ся одноименный агглютиноген, то наступит реакция агглютинации - склеивание эритроцитов. Реакция агглютинации бывает специфической (истинной) и неспецифической.

К специфической реакции агглютинации относятся:

1. Изогемагглютинация, при которой склеивание эритроцитов проис­ходит за счет взаимодействия одноименного агглютинина и агглютиногена. Она устойчивая и является решающей при определении группы крови;

2. Холодовая агглютинация - это истинная агглютинация эритроци­тов, проявляющаяся при температуре ниже +15°С, за счет наличия в сыво­ротке холодового агглютинина.

К неспецифической реакции агглютинации относятся:

1. Ложная агглютинация (псевдоагглютинация), при которой проис­ходит склеивание эритроцитов в "монетные столбики". Эта реакция явля­ется физиологической и не зависит от агглютинационных свойств эритро­цитов. Кроме того, при длительном наблюдении с периферии капли начи­нается высыхание и проявляется краевая псевдоагглютинация. Ложную агглютинацию легко отличить от истинной путем добавления капли изото­нического раствора хлористого натрия, и после помешивания агглютина­ция исчезает.

2. Панагглютинация - явление, при котором сыворотка крови дает агглютинацию со всеми эритроцитами при комнатной температуре, а эрит­роциты - со всеми сыворотками, даже с сывороткой четвертой группы. Это явление встречается у ряда больных при изменении белкового состава сы­воротки крови, а именно, при преобладании глобулинов или появлении макроглобулинов, что наблюдается при хронических воспалительных про­цессах (заболевания печени, почек), диспротеинемии, злокачественных опухолях, гематологических заболеваниях. Чаще верхним пределом для этой реакции является температура +30°С (в живом организме такой тем­пературы не бывает). Панагглютинация ослабевает при подогревании та­релочки в термостате при температуре +37°С в течение 5-6 минут, а при +45°С способность к панагглютинации исчезает.

3. Феномен Томсона. Он имеет место при инфицировании крови, в этом случае эритроциты агглютинируются всеми стандартными сыворот­ками. Это происходит за счет протеолитических ферментов бактерий, ко­торые обладают способностью активировать Т-антиген эритроцитов и воз­никает агглютинация анти-Т-агглютининами, а они содержатся в сыворот­ке всех людей. В этом случае реакция агглютинации устраняется подогре­ванием тарелочки в термостате при температуре +37°С в течение 5-6 ми­нут.

Реакция агглютинации (от лат. agglutinatio - склеивание) - склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов.

Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул (например, бактерий), «склеенных» антителами (рис. 7.37). Реакцию агглютинации используют для: определения возбудителя , выделенного от больного; определения антител в сыворотке крови больного; определения групп крови.

Рис. 7.37 а,б . Реакция агглютинации с IgM -антителами (а) и IgG -антителами (б )

1. Определение возбудителя, выделенного от больного Ориентировочная реакция агглютинации на стекле (рис. 7.38). К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1:20) добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. Образуется хлопьевидный осадок.

Рис. 7.38.

Развернутая реакция агглютинации с возбудителем, выделенным от больного (рис. 7.39). К разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного.

Рис. 52

2. Определение антител в сыворотке крови больного
Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови больного (рис. 7.39). К разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум.
- Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие 0-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.
- Агглютинация с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.
3. Реакция агглютинации для определения групп крови Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВО (табл. б) с помощью агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки против антигенов групп крови А (И), В (III). Контролем служат: сыворотка, не содержащая антител, т.е. сыворотка АВ (IV) группы крови; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов, т. е. используют эритроциты группы О (I).

Таблица 7.6. Определение групп крови АВО

Агглютинация (лат. agglutinatio – склеивание) – склеивание в комочки эритроцитов, лейкоцитов и других клеточных элементов с адсорбированными на их поверхности антигенами и антителами и выпадение их в осадок при воздействии электролитов.

Реакция агглютинации бывает:

• специфическая;
• неспецифическая, или химическая;
• спонтанная.

Для проведения специфической агглютинации необходимо наличие 3-ех компонентов:

1. агглютиногена – взвеси клеток антигенов;
2. агглютининов – антител, которые образуются в организме человека при появлении в нем микробов;
3. электролитов – в их изотоническом растворе ставят реакцию.

Чтобы образовался агглютинат (осадок), необходимо соблюдать правильное соотношение антигенов и антител. Такое соотношение называется феноменом оптимума . Если антитела будут находиться в меньшем или большем количестве, чем следует, произойдет задержка реакции.

Агглютинины, используемые в реакции, делятся на групповые и специфические:

• Групповые реагируют не только на микробы, которые были использованы для иммунизации, но и на микробы, имеющие с ними общие антигены;
• Специфические агглютинины обуславливают реакцию агглютинации только с микробами, которые использовались для иммунизации.

Для освобождения сыворотки от групповой агглютинации её разводят или применяют Кастеллани реакцию.

Реакция агглютинации используется для того, чтобы определить вид микроба, и чтобы обнаружить антитела в сыворотках вакцинированных или больных людей. Существует большое количество реакций агглютинации, при помощи которых можно диагностировать вирусные заболевания, например, сыпной или брюшной тиф, парафиты.

Для постановки реакции в пробирках разводят сыворотку в отношении 1:50; 1:100; 1:200; 1:400; 1:800; 1:1000 и так далее. Затем в пробирки добавляют одинаковое количество микробной взвеси. Пробирки помещаются в термостат, где содержатся при температуре +37 градусов в течение 2 часов, затем проводится предварительный учет. Окончательный учет производят на следующий день, все это время пробирки содержатся при комнатной температуре.

Агглютинация может быть определена макроскопически, то есть невооруженным глазом, или микроскопически, с использование .

Реакция агглютинации (РА) оценивается в крестах в зависимости от степени просветления жидкости и получившегося осадка :

1. — ++++ — полное просветление раствора, появление осадка в виде зонтика, который при встряхивании разбивается на хлопья;
2. — +++ — слегка подкрашенная жидкость;
3. — ++ — мутная жидкость, незначительный осадок;
4. — + — отрицательная реакция, мутная жидкость без осадка, либо осадок разбивается равномерно.

Неспецифическая агглютинация возникает от изменения pH среды, спонтанная наблюдается при суспендировании бактерий, которые находятся в R-форме, в физиологическом растворе и при нагревании.

Агглютинация - это явление склеивания взвешенных в солевом растворе микробов или частей микробных клеток, с образованием хлопьев или мелких зерен, выпадающих в осадок. Различают специфическую и неспецифическую агглютинации. Специфическая агглютинация происходит при участии трех компонентов: агглютиногена (взвесь клеток), агглютининов ( , содержащиеся в иммунной сыворотке, полученной после введения в организм животного или человека микробов этого вида) и солей (), в изотоническом растворе которых обычно ставится реакция.

Постановка реакции: в пробирках готовят разведения сыворотки 1: 50; 1: 100; 1: 200; 1: 400; 1: 800; 1: 1000 и выше. В каждую пробирку добавляют одно и то же количество микробной взвеси. Предварительный учет реакции производят спустя 2 часа после помещения пробирок в при t° 37°; окончательный - на следующий день после выдерживания пробирок при комнатной температуре. Оценка результатов реакции производится невооруженным , при помощи лупы или агглютиноскопа - прибора, в котором взвесь микробов и образовавшиеся комочки или хлопья рассматривают через подвижной окуляр в проходящем свете. Положительный результат реакции отмечают обычно по наибольшему разведению сывороток, в котором наступила выраженная агглютинация. Диагностическое значение имеет положительная реакция с сывороткой больного в разведении от 1: 200 и выше (при последующем нарастании титра).

При ускоренной реакции агглютинации (по Ноблю) 0,1 мл пятимиллиардной взвеси микробов смешивают с равным объемом исследуемой сыворотки в разведениях 1: 10; 1: 20; 1: 40 и 1: 80 и через 3-5 минут после добавления 0,8 мл 0,85% раствора учитывают реакцию. Для определения вида микроба реакцию агглютинации ставят с набором агглютинирующих сывороток, каждая из которых получена при иммунизации животного определенным видом микробов.

При ориентировочной реакции агглютинации на предметное стекло наносят каплю взвеси исследуемого микроба и каплю специфической агглютинирующей сыворотки 1: 10; 1: 20. Обе капли смешивают и через несколько минут наблюдают результат.

Реакция агглютинации основана на специфическом взаимодействии антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками. В результате такого взаимодействия образуются частицы-агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат). В реакции агглютинации могут участвовать бактерии, простейшие, грибы, дрожжи, риккетсии, эритроциты и другие клетки, как живые, так и убитые. Протекает реакция в две фазы:

• первая - специфическое соединение антигена и антитела,
• вторая - неспецифическая, т. е. образование видимого агглютината.

Выпадение агглютината происходит в присутствии электролитов, например, хлорида натрия. Находящиеся в агглютинате микроорганизмы остаются живыми, но теряют подвижность.

Реакцию агглютинации широко применяют для серологической диагностики инфекционных заболеваний и определения антигенной структуры выделенных микробов. Для установления антигенной структуры возбудителя, выделенного из организма больного или носителя, используют специфическую иммунную сыворотку , полученную иммунизацией животных (кролика, осла, барана) определенными микроорганизмами. Идентификацию микроба проводят в реакции агглютинации на стекле с адсорбированными или монорецепторными сыворотками или в пробирках с видовыми агглютинирующими сыворотками. Адсорбированные сыворотки содержат антитела только к специфическим для данного микроба антигенам, а монорецепторные - только к одному специфическому антигену возбудителя. Видовые сыворотки содержат антитела ко всем антигенам определенного микроба.

Принадлежность выделенной культуры микроорганизма к данному виду определяется при агглютинации его известной сывороткой до титра антител, указанного на этикетке ампулы с сывороткой. Титром антител сыворотки считают последнее разведение ее, в котором еще наблюдается агглютинация культуры микробов, использованных для иммунизации животного. Адсорбированные и монорецепторные сыворотки используют обычно в реакции агглютинации на стекле неразведенными.

При определении наличия антител в сыворотке крови больного ее разводят изотоническим раствором хлорида натрия начиная с разведения 1: 50 до 1: 800 или более. В каждое разведение добавляют взвесь живых или убитых микробов. Препараты, содержащие микробы, убитые нагреванием или формалином, называют диагностикумами . Диагностикумы, полученные путем прогревания культур микроорганизмов, содержат только соматические антигены. При использовании только формалина у микробов сохраняются и жгутиковые антигены.

При наличии антител в крови больного происходит склеивание взятого в реакцию диагностикума и образование осадка (агглютината) на две пробирки. В этом случае результаты реакции агглютинации расценивают как положительные. В контрольной пробирке, куда вносят изотонический раствор хлорида натрия и диагностикум, взвесь микробов должна быть гомогенной (отрицательная реакция агглютинации).

Учет результатов реакции агглютинации при некоторых заболеваниях, например, лептоспирозе, проводят только микроскопически в темном поле зрения микроскопа (микроагглютинация). Для постановки серологического диагноза заболевания учитывают диагностический заболевание. Обычно он соответствует разведению сыворотки 1: 100 или 1: 200.

Антитела в сыворотке крови больного с помощью реакции агглютинации можно выявить при заболевании брюшным тифом и паратифах (реакция Видаля), бруцеллезе (реакция Райта), туляремии и др.

Реакция Кастеллани . При некоторых инфекционных заболеваниях или иммунизации микроорганизмами, имеющими в своем составе групповые антигены, в сыворотке крови, помимо специфических для данного вида антител, появляются еще и групповые. В этом случае родственные виды бактерий будут агглютинироваться полученными сыворотками.

Кастеллани предложил метод адсорбции групповых антител из иммунных сывороток, основанный на удалении их с помощью микроорганизмов родственных видов, которые имеют групповые антигены, но лишены специфических. Культура таких микроорганизмов, добавленная в сыворотку, адсорбирует неспецифические групповые антитела, и после удаления комплекса антиген - антитело с помощью центрифугирования в сыворотке остаются только специфические иммуноглобулины. Сыворотки, обработанные по методу Кастеллани, могут быть использованы в реакции агглютинации как высокоспецифичные.

В основе реакции гемагглютинации лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов. Различают прямую и непрямую гемагглютинацию.

При реакции прямой гемагглютинации происходит склеивание эритроцитов при адсорбции на них определенных антигенов, например, вирусов.

В серологических исследованиях применяют реакцию торможения прямой гемагглютинации, когда выделенный у больного вирус нейтрализуют специфической иммунной сывороткой, а затем соединяют с эритроцитами. Отсутствие гемагглютинации говорит о соответствии вируса и используемой иммунной сыворотки.

Реакция непрямой гемагглютинации (пассивная гемагглютинация) наблюдается в тех случаях, когда к эритроцитам, заранее обработанным (сенсибилизированным) различными антигенами, прибавляют иммунную сыворотку или сыворотку больного, имеющую соответствующие антитела. Происходит специфическое Склеивание эритроцитов, их пассивная гемагглютинация.

Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации по чувствительности и специфичности превосходит другие серологические методы, и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими.

Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации состоит из нескольких этапов. Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1: 20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами. После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению. Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум. Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки. Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки.